高效液相色譜法的原理、儀器要求、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)及測定方法！
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高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進(jìn)行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各組分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄和處理色譜信號。
（一）對儀器的一般要求和色譜條件所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。
（1）色譜柱反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統(tǒng)使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。
填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團(tuán)的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應(yīng)選擇孔徑在15nm（1nm=10?）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規(guī)定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3～10μm之間，粒徑更小（約2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm）?。使用微徑柱時，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時，應(yīng)以品種項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。以硅膠為載體的鍵合固定相的便用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃。
流動相的pH值應(yīng)控制在2～8之間。當(dāng)pH值大于8時，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH值小于2時，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH值大于8的流動相時，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機(jī)-無機(jī)雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當(dāng)需使用pH值小于2的流動相時，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機(jī)-無機(jī)雜化填充劑等。
（2）檢測器：最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。
紫外、熒光、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與供試品溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測器對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與供試品的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。
紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進(jìn)行計(jì)算時，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應(yīng)符合紫外-可見分光光度法項(xiàng)下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應(yīng)考慮有機(jī)相中有機(jī)溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機(jī)溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)性鹽組分的流動相。
（3）流動相：反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇-水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈-水系統(tǒng)）?，如經(jīng)試用不適合時，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動相。由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機(jī)溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機(jī)卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。
各品種項(xiàng)下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)供試品并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。其中，調(diào)整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小于或等于50%）相對于自身的改變量不超過±30%且相對于總量的改變量不超過±10%為限，如30%相對改變量的數(shù)值超過總量的10%時，則改變量以總量的±10%為限。
對于必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項(xiàng)下注明。
（二）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
色譜系統(tǒng)的適用性試驗(yàn)通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等4個參數(shù)。其中，分離度和重復(fù)性尤為重要。按各品種項(xiàng)下要求對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗(yàn)，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，必要時，可對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以符合要求。
（1）色譜柱的理論板數(shù)（n）用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)，一般為待測組分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計(jì)）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2）?，按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。
（2）分離度（R）?：用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)。可以通過測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度、也可以通過測定待測組分與某一添加的指標(biāo)性成分（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)前方法降解，通過測定待測組分與某一降解產(chǎn)物的分離度舉對色譜系統(tǒng)進(jìn)行評價與控制。無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰或特定的雜質(zhì)對照峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。
（3）重復(fù)性：用于評價連續(xù)進(jìn)樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時，通常取各品種項(xiàng)下的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%；采用內(nèi)標(biāo)法時，通常配制相當(dāng)于80%,100%和120%的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計(jì)算平均校正因子。其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。
（4）拖尾因子（T）?：用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定。
除另有規(guī)空外，峰高法定量時T應(yīng)在0.95～1.05之間。峰面積法測定時，若拖尾嚴(yán)重，將影響峰面積的準(zhǔn)確測量。必要時，應(yīng)在各品種項(xiàng)下對拖尾因子作出規(guī)定。
（三）測定法
（1）內(nèi)標(biāo)法：按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子側(cè)定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，
（2）外標(biāo)法：按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高）?，
由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)來用外標(biāo)法測定供試品中成分或雜質(zhì)含量時，以定量環(huán)或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。
（3）加校正因子的主成分自身對照法：測定雜質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按上述內(nèi)標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測峰面積。這些需作校正計(jì)算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。
測定雜質(zhì)含量時，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤海M(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進(jìn)樣量（以柱子不過載為限）?，使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的10%～25%或其峰面積能準(zhǔn)確積分〔通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)小于10%；含量在0.5%～2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2%〕。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計(jì)算各雜質(zhì)含量。
（4）不加校正因子的主成分自身對照法：測定雜質(zhì)含量時，若沒有雜質(zhì)對照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述加校正因子的主成分自身對照法配制對照溶液并調(diào)節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進(jìn)樣，前者的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜32圖Ⅰ，再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰）?，減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峰面積，即為總雜質(zhì)峰的校正面積。然后依法計(jì)算。
（5）面積歸一化法：按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率。
用于雜質(zhì)檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，通常只用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。
發(fā)布于: 2025-04-09