體積排阻色譜柱：原理、應(yīng)用及與其他色譜柱的比較！
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體積排阻色譜柱(Size Exclusion Chromatography Column，簡(jiǎn)稱 SEC 柱)是液相色譜中一種基于分子尺寸(體積)差異實(shí)現(xiàn)分離的特殊色譜柱，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、高分子材料、藥物分析等領(lǐng)域。以下從基本定義、分離原理、核心應(yīng)用場(chǎng)景三方面展開(kāi)介紹：
一、體積排阻色譜柱的定義
體積排阻色譜柱內(nèi)部填充有多孔性凝膠填料(如葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺或硅膠基質(zhì)微球)，其分離機(jī)制不依賴分子的電荷、極性或疏水性，而是完全基于分子的尺寸( hydrodynamic volume)和形狀。
關(guān)鍵特點(diǎn)：
填料孔徑大小決定分離范圍(如小分子可進(jìn)入小孔，大分子被排阻)。
分離過(guò)程溫和，適合不耐高溫、易變性的生物大分子(如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等)。
二、分離原理：分子篩效應(yīng)(Molecular Sieving)
1、核心機(jī)制
流動(dòng)相攜帶樣品進(jìn)入色譜柱，分子根據(jù)尺寸差異擴(kuò)散到填料孔隙中：
大分子：無(wú)法進(jìn)入填料微孔，只能沿填料顆粒間的空隙流動(dòng)，路徑短，保留時(shí)間短，先流出。
小分子：可進(jìn)入填料微孔內(nèi)部，流動(dòng)路徑長(zhǎng)，保留時(shí)間長(zhǎng)，后流出。
分離結(jié)果：分子按尺寸從大到小依次洗脫，實(shí)現(xiàn)分級(jí)分離。
填料顆粒結(jié)構(gòu)：〇〇〇(多孔網(wǎng)絡(luò))
大分子 → 直接通過(guò)顆粒間隙 → 快速流出
小分子 → 進(jìn)入孔隙內(nèi)部 → 緩慢流出
2、影響分離的關(guān)鍵參數(shù)
填料孔徑：決定可分離的分子量范圍(如孔徑小的柱子適合分離低分子量物質(zhì))。
柱長(zhǎng)與流速：柱長(zhǎng)增加可提高分離度，流速過(guò)快可能降低分離效果。
流動(dòng)相組成：需維持樣品溶解性和穩(wěn)定性(如緩沖液 pH、離子強(qiáng)度等)。
三、應(yīng)用場(chǎng)景
體積排阻色譜柱因其溫和性和尺寸選擇性，在以下領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用：
1. 生物大分子分析
蛋白質(zhì)與多肽：
分離蛋白質(zhì)單體、多聚體(如抗體藥物的聚集體檢測(cè))。
測(cè)定蛋白質(zhì)分子量分布(需結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品校正)。
監(jiān)測(cè)蛋白降解或變性(如溫度、pH 對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響)。
核酸：
分離 DNA/RNA 的不同構(gòu)型(如超螺旋 DNA 與線性 DNA)。
評(píng)估核酸完整性(如降解產(chǎn)物與完整鏈的區(qū)分)。
多糖與疫苗：
分析疫苗中多糖的分子量均一性(如肺炎疫苗多糖純度檢測(cè))。
分離病毒樣顆粒(VLPs)或病毒載體的完整性。
2. 高分子材料研究
聚合物分子量分布：測(cè)定合成高分子(如聚乙烯、聚丙烯酸)的分子量及其分布(GPC，凝膠滲透色譜，屬于體積排阻色譜的一種)。
聚合物純度與降解：檢測(cè)聚合物中的低聚物、雜質(zhì)或降解產(chǎn)物。
3. 藥物研發(fā)與質(zhì)量控制
生物藥分析：
ADC 藥物(抗體 – 藥物偶聯(lián)物)中游離藥物與偶聯(lián)物的分離。
宿主細(xì)胞蛋白(HCP)與目標(biāo)蛋白的快速分離(如細(xì)胞培養(yǎng)液純化監(jiān)控)。
小分子藥物輔助分析：分離藥物中的高分子雜質(zhì)(如蛋白類污染物)。
4. 其他領(lǐng)域
食品與農(nóng)業(yè)：檢測(cè)食品中多糖(如果膠、淀粉)的分子量，評(píng)估品質(zhì)。
環(huán)境科學(xué)：分離環(huán)境樣品中的高分子污染物(如腐殖酸)。
體積排阻色譜柱是利用 “分子篩” 原理實(shí)現(xiàn)分子尺寸分離的工具，具有溫和、高效、無(wú)樣品損失的特點(diǎn)，尤其適合生物大分子的分析與純化。隨著生命科學(xué)與材料科學(xué)的發(fā)展，其在藥物研發(fā)、質(zhì)量控制、基礎(chǔ)科研中的應(yīng)用將更加廣泛。如需選擇具體型號(hào)(如恒譜生 Bio-SEC 柱)，需根據(jù)目標(biāo)分子尺寸、檢測(cè)需求(如靈敏度、載樣量)及儀器兼容性綜合考量。
四、體積排阻色譜柱與其他色譜柱的比較
1、分離機(jī)制：核心差異
| 色譜類型 | 分離機(jī)制 | 關(guān)鍵影響因素 |
| 體積排阻色譜柱（SEC） | 基于分子尺寸（ hydrodynamic volume）差異，利用填料孔隙的 “分子篩效應(yīng)” 分離： - 大分子無(wú)法進(jìn)入孔隙，先流出； - 小分子進(jìn)入孔隙，后流出。 |
填料孔徑大小、分子體積 / 形狀 |
| 反相色譜柱（RP-HPLC） | 基于分子疏水性差異： ‘- 疏水性強(qiáng)的分子與固定相（如 C18）作用強(qiáng)，保留時(shí)間長(zhǎng)； ‘- 極性分子先流出。 |
固定相疏水性（C18/C8 等）、流動(dòng)相極性（如乙腈 / 水比例） |
| 離子交換色譜柱（IEC） | 基于分子電荷差異： ‘- 帶電荷分子與固定相（如磺酸基 / 季銨基）發(fā)生靜電吸附，電荷密度高的分子保留時(shí)間長(zhǎng)。 |
固定相電荷基團(tuán)類型（陽(yáng)離子 / 陰離子交換）、流動(dòng)相 pH 和離子強(qiáng)度 |
| 親和色譜柱（AC） | 基于生物分子特異性相互作用（如抗體 – 抗原、酶 – 底物）： ‘- 目標(biāo)分子與固定相配體特異性結(jié)合，其他分子先流出，通過(guò)改變條件洗脫目標(biāo)分子 |
配體類型（如 Protein A、肝素）、洗脫條件（pH、競(jìng)爭(zhēng)性分子） |
| 正相色譜柱（NP-HPLC） | 基于分子極性差異： ‘- 極性分子與固定相（如硅膠、氨基柱）作用強(qiáng)，保留時(shí)間長(zhǎng)； ‘- 非極性分子先流出。 |
固定相極性（硅膠 / 氰基柱等）、流動(dòng)相極性（如正己烷 / 異丙醇比例） |
2、填料特性：決定分離機(jī)制的基礎(chǔ)
| 色譜類型 | 填料材質(zhì)與結(jié)構(gòu) | 孔徑與表面性質(zhì) |
| 體積排阻色譜柱（SEC） | 多孔凝膠填料（如硅膠基質(zhì)微球、葡聚糖、瓊脂糖），孔徑分布均勻，表面惰性（減少非特異性吸附）。 | 孔徑大小決定分離范圍（如小孔徑分離低分子量，大孔徑分離蛋白質(zhì)等大分子）。 |
| 反相色譜柱（RP-HPLC） | 硅膠基質(zhì)鍵合疏水性基團(tuán)（如 C18、C8、苯基），表面疏水。 | 孔徑通常較?。?-12 nm），適合小分子（<2000 Da）。 |
| 離子交換色譜柱（IEC） | 硅膠或聚合物基質(zhì)鍵合離子基團(tuán)： | 孔徑適中（8-10 nm），表面帶電荷，需控制流動(dòng)相 pH 使目標(biāo)分子帶電。 |
| - 陽(yáng)離子交換（如磺酸基 – SO??）； | ||
| - 陰離子交換（如季銨基 – NR??）。 | ||
| 親和色譜柱（AC） | 基質(zhì)（如瓊脂糖、硅膠）偶聯(lián)特異性配體（如 Protein A、鎳離子、肝素）。 | 大孔徑（如瓊脂糖凝膠孔徑可達(dá)數(shù)百 nm），便于大分子擴(kuò)散結(jié)合配體。 |
| 正相色譜柱（NP-HPLC） | 極性固定相（如未鍵合硅膠、氨基柱、氰基柱），表面富含羥基或極性基團(tuán)。 | 孔徑較小，依賴表面極性基團(tuán)與分子相互作用。 |
3、應(yīng)用場(chǎng)景：因機(jī)制而異
| 色譜類型 | 典型應(yīng)用 | 適合的樣品類型 |
| 體積排阻色譜柱（SEC） | - 生物大分子分離：蛋白質(zhì)聚集體、核酸構(gòu)型、病毒顆粒完整性分析； | 大分子（>1000 Da）、對(duì)剪切力 / 化學(xué)環(huán)境敏感的生物樣品（如抗體、酶）。 |
| - 聚合物分子量分布測(cè)定（GPC）； | ||
| - 溫和條件下的樣品脫鹽或緩沖液交換。 | ||
| 反相色譜柱（RP-HPLC） | - 小分子藥物分析（如阿司匹林、抗生素）； | 中低分子量（<5000 Da）、具疏水性的化合物（如多肽、小分子有機(jī)物）。 |
| - 多肽測(cè)序與純度檢測(cè)； | ||
| - 環(huán)境污染物（如 PAHs）分離。 | ||
| 離子交換色譜柱（IEC） | - 蛋白質(zhì)電荷異構(gòu)體分離（如單抗電荷異質(zhì)性分析）； | 帶電生物分子（蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸），需通過(guò) pH 調(diào)節(jié)電荷狀態(tài)。 |
| - 核酸分離（如質(zhì)粒 DNA 純化）； | ||
| - 氨基酸分析。 | ||
| 親和色譜柱（AC） | -?抗體純化（Protein A/G?柱）； | 目標(biāo)分子需具備特異性結(jié)合位點(diǎn)（如抗體 Fc 段、His 標(biāo)簽），適合純化或互作分析。 |
| - 重組蛋白分離（His 標(biāo)簽 – Ni 柱）； | ||
| - 受體 – 配體相互作用研究。 | ||
| 正相色譜柱（NP-HPLC） | - 手性化合物分離； | 極性分子（如糖類、天然產(chǎn)物），流動(dòng)相需用非極性溶劑（如正己烷）。 |
| - 極性小分子（如糖類、脂類）分析； | ||
| - 藥物中間體純度檢測(cè)。 |
4、關(guān)鍵對(duì)比總結(jié)
| 維度 | 體積排阻色譜柱（SEC） | 反相色譜柱（RP-HPLC） | 離子交換色譜柱（IEC） | 親和色譜柱（AC） |
| 分離核心 | 分子尺寸 / 孔徑篩分 | 疏水性差異 | 電荷差異 | 特異性生物相互作用 |
| 是否破壞樣品 | 否（溫和分離，無(wú)化學(xué)作用） | 可能（流動(dòng)相含有機(jī)溶劑，可能變性） | 否（依賴電荷，不破壞結(jié)構(gòu)） | 否（特異性結(jié)合，條件溫和） |
| 典型樣品 | 抗體、DNA、聚合物 | 小分子藥物、多肽 | 帶電蛋白、核酸 | 帶標(biāo)簽蛋白、抗體 |
| 流動(dòng)相要求 | 水相緩沖液（需維持樣品穩(wěn)定） | 水 – 有機(jī)溶劑（如乙腈、甲醇） | 水相緩沖液（含鹽調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度） | 水相緩沖液（需含特異性洗脫劑） |
| 分離速度 | 較快（分子僅按尺寸擴(kuò)散，無(wú)吸附過(guò)程） | 中等（依賴疏水性相互作用動(dòng)力學(xué)） | 中等（依賴電荷吸附平衡） | 較慢（需特異性結(jié)合 – 洗脫動(dòng)力學(xué)） |
5、如何選擇色譜柱?
1. 根據(jù)樣品性質(zhì)：
● 大分子、易變性樣品 → SEC 柱(如抗體聚集體分析)。
● 小分子、疏水性強(qiáng) → 反相柱(如藥物含量檢測(cè))。
● 帶電分子(如蛋白電荷異質(zhì)性)→ 離子交換柱。
● 需高效純化特定生物分子 → 親和柱(如抗體純化)。
2. 根據(jù)分離目標(biāo)：
● 按尺寸分級(jí)(如分子量分布)→ SEC;
●?按極性 / 疏水性分離 → 反相 / 正相;
● 按電荷分離 → 離子交換;
● 按特異性結(jié)合分離 → 親和。
通過(guò)以上差異對(duì)比，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求選擇最適配的色譜柱類型。例如，恒譜生 Bio-SEC 體積排阻色譜柱即針對(duì)生物大分子的尺寸分離優(yōu)化，通過(guò)特殊鍵合工藝降低非特異性吸附，適合對(duì)靈敏度、柱壽命要求高的生物分析場(chǎng)景(如 ADC 藥物偶聯(lián)效率檢測(cè)、疫苗蛋白聚集狀態(tài)分析等)。
發(fā)布于: 2025-05-24